Il gioco si svolge quasi interamente tra Monteriggioni e Roma. Nel borgo toscano viene consolidata Villa Auditore, quartier generale della setta degli Assassini, già presente nel capitolo precedente della serie; la capitale, così come accaduto con Venezia e Firenze nel capitolo precedente, è stata ricostruita con ampia ricchezza di dettagli. La Monteriggioni del gioco riprende le mura di cinta della cittadina toscana; non esiste tuttavia alcuna Villa Auditore nella realtà (sebbene una magione molto simile si trovi poco lontana dalle mura cittadine). La città di Roma, nel gioco, è tre volte più grande di Firenze. Ricostruita con confronti tra mappe moderne e mappe dell’epoca, è degno di nota il lavoro minuzioso non solo sul contesto urbano, ma anche sulla campagna romana e sulla città sotterranea. È inoltre molto interessante l’interazione con il patrimonio artistico tramite una particolare modalità di “recupero”: il protagonista deve liberare le varie zone della città dall’influenza dei Borgia, contribuendo alla costruzione di nuove botteghe e al restauro di monumenti come il Pantheon o il Colosseo. Alcune missioni si svolgono sui Colli Albani, sul Monte Circeo, nella Valnerina e a Napoli. Nel penultimo caso, non sono riconoscibili location specifiche: la Valnerina prende il nome dal fiume Nera, che sgorga dai Monti Sibillini nelle Marche, e si sviluppa prevalentemente in Umbria. La fortezza rappresentata nella missione, sebbene genericamente medievale, potrebbe forse rimandare alla Rocca Borgesca fatta erigere da Cesare Borgia a Camerino (comune a nord dei Monti Sibillini). All'inizio del Cinquecento, Leonardo da Vinci fu assoldato proprio da Cesare Borgia, che ne sfruttò le competenze militari (come si evince dalla missione presente in Brotherhood). Nel caso invece di Napoli sono riconoscibili il Vesuvio e Castel dell’Ovo. Rimangono tuttavia presenti nell’opera le solite ma trascurabili imprecisioni storiche (vedi la presunta rivalità tra Machiavelli – Gran Maestro degli Assassini – e Cesare Borgia – Gran Maestro dei Templari: nella realtà lo scrittore fu ispirato proprio dal condottiero per il ritratto del protagonista della sua famosa opera Il Principe). Nella città eterna sarà possibile invece esplorare diversi luoghi d’interesse, tra cui oltre a Pantheon e Colosseo, Castel Sant’Angelo, Terme di Diocleziano e Terme di Caracalla e diversi altri. Lo stile architettonico complessivo è più barocco che tardo rinascimentale, in quanto la città sarebbe apparsa molto simile alla Firenze del capitolo precedente.
Il gioco si svolge quasi interamente tra Monteriggioni e Roma. Nel borgo toscano viene consolidata Villa Auditore, quartier generale della setta degli Assassini, già presente nel capitolo precedente della serie; la capitale, così come accaduto con Venezia e Firenze nel capitolo precedente, è stata ricostruita con ampia ricchezza di dettagli. La Monteriggioni del gioco riprende le mura di cinta della cittadina toscana; non esiste tuttavia alcuna Villa Auditore nella realtà (sebbene una magione molto simile si trovi poco lontana dalle mura cittadine). La città di Roma, nel gioco, è tre volte più grande di Firenze. Ricostruita con confronti tra mappe moderne e mappe dell’epoca, è degno di nota il lavoro minuzioso non solo sul contesto urbano, ma anche sulla campagna romana e sulla città sotterranea. È inoltre molto interessante l’interazione con il patrimonio artistico tramite una particolare modalità di “recupero”: il protagonista deve liberare le varie zone della città dall’influenza dei Borgia, contribuendo alla costruzione di nuove botteghe e al restauro di monumenti come il Pantheon o il Colosseo. Alcune missioni si svolgono sui Colli Albani, sul Monte Circeo, nella Valnerina e a Napoli. Nel penultimo caso, non sono riconoscibili location specifiche: la Valnerina prende il nome dal fiume Nera, che sgorga dai Monti Sibillini nelle Marche, e si sviluppa prevalentemente in Umbria. La fortezza rappresentata nella missione, sebbene genericamente medievale, potrebbe forse rimandare alla Rocca Borgesca fatta erigere da Cesare Borgia a Camerino (comune a nord dei Monti Sibillini). All'inizio del Cinquecento, Leonardo da Vinci fu assoldato proprio da Cesare Borgia, che ne sfruttò le competenze militari (come si evince dalla missione presente in Brotherhood). Nel caso invece di Napoli sono riconoscibili il Vesuvio e Castel dell’Ovo. Rimangono tuttavia presenti nell’opera le solite ma trascurabili imprecisioni storiche (vedi la presunta rivalità tra Machiavelli – Gran Maestro degli Assassini – e Cesare Borgia – Gran Maestro dei Templari: nella realtà lo scrittore fu ispirato proprio dal condottiero per il ritratto del protagonista della sua famosa opera Il Principe). Nella città eterna sarà possibile invece esplorare diversi luoghi d’interesse, tra cui oltre a Pantheon e Colosseo, Castel Sant’Angelo, Terme di Diocleziano e Terme di Caracalla e diversi altri. Lo stile architettonico complessivo è più barocco che tardo rinascimentale, in quanto la città sarebbe apparsa molto simile alla Firenze del capitolo precedente.
Ezio Auditore è nuovamente protagonista di questo episodio, sequel diretto del capitolo precedente conclusosi a Roma, a Castel Sant’Angelo. Ezio dovrà affrontare gli esponenti della famiglia dei Borgia, appartenenti all’ordine dei Templari, proprio nella capitale italiana. A guidare la fazione nemica è il famoso condottiero Cesare Borgia. Il gioco si sviluppa come il capitolo precedente, senza sostanziali modifiche, tranne che per l’aggiunta di una modalità multigiocatore che permette di utilizzare altri personaggi oltre al protagonista Ezio.